情動適応・変容における大規模神経機能ネットワーク動態の解明，2020年04月 - 2023年03月

概要： 複数の時間枠において活動した神経細胞を、時間枠ごとに識別して標識するために構築したマウス（最初期遺伝子Fosの遺伝子座に薬物誘導型Cre組換え酵素とテトラサイクリン制御性トランス活性化因子を導入したマウス)を用いて、４ヒドロキシタモキシフェンまたはドキシサイクリン投与により細胞を標識可能か検証した。アデノ随伴ウイルスベクターを用いて、各レポーター遺伝子を導入した結果、各薬物投与によりいずれの遺伝子発現制御系を用いた蛍光標識も可能であることが分かった。各薬物を介した標識効率を同程度にするためには、薬物の濃度だけでなく、薬物の投与時期と環境刺激を負荷する時期の時間間隔など、より細かな検証が必要と考えられる。また、画像解析では、GPUを用いた画像処理により全脳画像の各視野の連結および蛍光シグナルの抽出に要する時間を約30%程度（HDDからの読み込み等、画像処理以外に要する時間も含む）削減することに成功した。マウス全脳をAllen mouse brain atlasに登録されている300程度の脳領域の解析に加えて、脳半球を区別し、必要に応じて左右差などについても検証可能な解析系を確立した。
また、解析方法の確立過程において、既存の神経活動レポーターマウスを用いた全脳解析をより詳細に実施し、ストレス暴露による神経活動の時間変化を個体間で比較した結果、単回の社会的敗北ストレスに比べて、繰返しストレス暴露により脳幹や視床下部に存在するいくつかの微小神経核に顕著な神経活動の亢進が認められた。新型コロナウイルスの影響を受けて、神経活動依存的な標識の条件を検証するための繰越を要したものの、解析法の確立過程においてストレスによる情動機能の変化に関わり得る候補脳領域を複数特定できたことから、2021年度に計画していた当該脳領域の詳細な役割の解析には大きな遅延なく移行できたと考えられる。

脳疾患の解明と創薬へ向けた疾患モデル脳のマルチスケールデータ解析，2020年04月 - 2023年03月

概要： 本研究は、脳疾患と脳神経機能の発現機構の解析に貢献する観察・操作技術横断的な研究を推進するため、広範な空間分解能イメージングと細胞標識レポーターを用いた高精細・脳領域・細胞アトラスの構築を行い、正常脳と病態脳をアンバイアスに比較解析する方法を構築することを目的にしている。
本年度は、高精細全脳イメージング装置FASTを改良し、シナプス構造である樹状突起スパイン等を観察するための超解像ユニットを導入すると共に、ｚ方向の位置精度の向上、さらに高・低倍の対物レンズの併用・自動切り替え装置の開発を行った。
また、多機能アトラスに統合するデータとして、保有する3q29欠失マウスや薬物投与マウスの全脳活動マップのデータを取得した。

意志力のストレス適応機構とその破綻メカニズムの全脳イメージング解析，2019年04月 - 2021年03月

概要： 本研究では、社会忌避行動や不安様行動の亢進を引き起こす過度のストレス反応と、情動行動にほとんど影響しない程度のストレス反応の差別化に関わる神経活動変化や脳領域、細胞集団を特定するため、急性ストレス暴露の時間・回数に基いて、ストレスの強度に応じた行動変化と神経活動変化を脳全体で網羅的に解析した。ストレス強度の増大に伴って、315領域に分類した脳領域の中でも、青斑核において顕著なc-Fos発現細胞数の増加が認められたため、本年度は当該脳領域の化学遺伝学的な活動操作や薬理学的な阻害が、行動に及ぼす影響を解析し、ストレス暴露時のノルアドレナリン神経系の機能操作が、翌日以降の社会性忌避行動を抑制することを見出した。また、ストレス暴露時に活動する青斑核のノルアドレナリン神経の神経投射などを全脳イメージングにより解析するため、独自に発現調節配列などを変更したアデノ随伴ウイルスベクターAAV-mDBH-tTAを作製した。本AAVとTREプロモーター制御下に蛍光タンパク質を発現するAAVを用いた条件では、青斑核における蛍光タンパク質発現細胞の92.8%がTH陽性であり、全脳イメージング技術FASTと組み合わせることで、全脳領域における青斑核ノルアドレナリン神経の神経投射を軸索レベルの分解能で捉えることが可能になった。これらの研究を通して、青斑核の活動がストレスの抵抗性・脆弱性を双方向性に制御する可能性を見出し、また当該脳領域を標的とした新たな細胞標識・遺伝子導入用のAAVを構築することに成功した。

潜在的なストレス耐性の個体差を担う神経基盤の全脳解析，2019年04月 - 2021年03月

概要： 本課題では、ストレス暴露により顕在化するストレス耐性の個体差情報をマウスの行動変化を指標として取得し、ストレスを受ける以前の潜在的な脳機能・神経活動の個体差との相関から、個体ごとに異なる潜在的なストレス耐性の創発機構を捉えるための解析法の確立に取り組んでいる。これまでに構築してきた全脳イメージング装置FASTを用いた解析では、脳領域を約20程度に分類して解析していたが、マウス脳の自家蛍光画像を用いた平均化FAST全脳アトラスを構築することで、50マイクロメートル単位程度の微小脳領域の比較解析が可能になった。本年度は、当初予定していたTRAP2マウスを用いて、ストレス暴露時にc-Fosを発現した細胞を半永久的に標識する解析を実施した。現時点までに構築した解析方法では社会性相互作用時間などの行動変化と相関する活動変化を検出することが容易ではなく、脳領域の分類に加えて、社会性行動を詳細に分析し、近づき行動や匂いかぎ行動などに分類することで行動変化と相関する脳領域を見出せる可能性が考えられる。代替法としてc-fosプロモーター制御下にEGFPを発現するFosEGFPマウスを用いた解析では、単回の社会的敗北ストレスにより視床室傍核や視床結合核、内側手綱核周辺においてストレス反応の個体差を部分的に反映すると考えられる、EGFP陽性細胞数の個体差が認められた。代替法の導入など一部の計画に修正を要したものの、これらの結果から、ストレス応答の個性・多様性に関わる神経基盤の解明に資する、新たな画像データ解析法の確立に成功し、個体によってストレスに対する反応性の異なる候補脳領域を推定できたたと考えられる。

高精細全脳イメージングによる一細胞レベルの四次元活動マッピング法の確立，2018年06月 - 2020年03月

概要： 本研究では、経験依存的な脳機能変化の細胞レベルの神経基盤を明らかにするため、経験の前と後など複数の時間枠で活動した神経細胞を、時間枠ごとに異なる色の蛍光蛋白質で標識可能なマウスを構築し、当該マウスの全脳イメージングによる神経活動の時間・空間の変化を捉える解析法の構築を目指している。平成30年度は、活動依存的に複数種の遺伝子発現制御系を誘導する遺伝子配列の構築と、各遺伝子発現誘導系に応じて異なる色の蛍光蛋白質を発現するマウスの構築、作製予定のマウスに適した画像解析法の検証を実施した。
活動依存的な発現では、c-fos遺伝子の1st exonの一部を含む720 bpのプロモーター領域や、c-fosの1st intron領域、両者の間に存在する約160 bpのexon領域の一部を用いた配列を検証し、レポーター遺伝子の発現効率が高い条件を決定した。また、本プロモーター制御によるCre組換え酵素およびテトラサイクリン制御性トランス活性化因子などの遺伝子発現制御系の発現も確認できた。
ノックインマウス構築では、予定していた配列の一部に欠損が認められるものの、蛍光蛋白質の発現制御に必要な最低限の配列が導入されていると考えられる個体が得られた。現在繁殖と蛍光蛋白質の発現確認を行っている。また、引き続き全配列がノックインされたマウスの作製も進めている。
画像解析法の構築では、c-fos-EGFPマウスを用いて蛍光シグナルの抽出が可能な条件を探索し、利用する蛍光蛋白質とは異なる組み合わせの励起光波長とフィルターセットによるバックグラウンド検出条件を設定した。

一細胞レベルの四次元全脳活動マッピングによる精神疾患病態の新規解析法の確立，2017年08月 - 2019年03月

概要： 精神疾患などに関わる脳機能の変調は、病態の進行や薬物治療に伴って経時的にその状況が変化すると考えられる。そのため、複数時間枠における脳全体の活動を同一個体内で比較し、脳機能の経時変化に関わる細胞レベルの活動変化を捉えることは、精神疾患の病態や薬物治療の機序の理解に繋がると期待できる。
本年度は、新規神経活動レポーターマウスの開発と、細胞レベルの機能的ネットワーク解析法の確立に向けた検討により、以下の成果を得た。
c-fosプロモーターに加えてエンハンサー配列を付加することにより、ウイルスベクターを用いたin vivo遺伝子導入条件下において環境刺激に応答して発現するレポーター蛍光タンパク質の蛍光強度が上昇する傾向が認められ、遺伝子発現効率の向上に利用できる可能性を見出した。また、c-fosプロモーター制御下に蛍光タンパク質やテトラサイクリン制御性トランス活性化因子tTAなどを発現する遺伝子発現系を構築し、活動依存的な標識の時間分解能を制御するために、タンパク質分解配列の付加によるtTA発現制御の適切な条件を確立した。多くの場合、tTAのN末端に融合タンパク質を付加するとtTAの転写活性化能が著しく低下するが、融合方法の改変により、転写活性化能を維持しつつtTAの発現量を制御でき、時間分解能を調節できる可能性を見出した。
細胞レベルの機能的ネットワーク解析については、現在利用可能な神経活動レポーターマウスに社会的敗北ストレス等の環境刺激を与えた後の全脳画像を全脳イメージング装置FASTにより取得し、解析法の検証に必要な画像データを得た。本データを用いて、励起光の照射ムラの補正など、多色解析時に必要となる画像前処理方法を確立した。
これらを用いた新規レポーターマウスや解析法の構築により、脳全体の細胞レベルの活動の時間変化を捉える新しい脳機能解析手法の開発に繋がると期待できる。

三次元全脳イメージング法の構築と精神疾患モデル動物の脳構造解析，2014年04月 - 2017年03月

概要： 本研究では、当研究室で構築してきた、マウス全脳を細胞レベルの解像度でイメージングする装置を用いて、疾患モデルにおける脳構造や神経活動の変化を、全ての脳領域で解析し、精神疾患の病態や神経機能調節の機構の解明を目指す。昨年度までの研究において、活性化した神経細胞を標識するArc-dVenusマウスを用いて、N-methyl-D-aspartate (NMDA)受容体拮抗薬による統合失調症モデルの神経活動変化を解析し、いくつかの脳領域における神経活動の亢進を見出した。当該年度においては、上記の活動変化の意義や治療薬に対する反応性を全脳レベルで可視的に究明するため、以下の検討を行った。
1) 多数の脳領域の中でも、顕著なdVenus陽性細胞の増加が認められた眼窩前頭皮質を傷害し、NMDA受容体拮抗薬による行動異常に及ぼす影響を解析した。その結果、新奇環境下における自発運動量は偽手術群と同程度であったのに対し、眼窩前頭皮質の傷害により、NMDA受容体拮抗薬による多動が抑制されることを見出した。
2) NMDA受容体拮抗薬による神経活動変化に対する、抗精神病薬の作用を全脳レベルで解析した。ハロペリドールまたはクロザピンの前処置により、多くの脳領域においてdVenusの発現が抑制されるが、眼窩前頭皮質では、クロザピンによりdVenus陽性細胞が著しく減少するのに対し、ハロペリドールでは、ほとんど抑制されないことを見出した。
4) 上記の変化が、他の統合失調症モデルにも共通して認められるかを検証するため、メタンフェタミン投与マウスの全脳イメージングを実施し、神経活動パターンを比較した。その結果、薬物による多動は同程度であるものの、全脳レベルでの活動パターンはモデル間で大きく異なること、その中でも、眼窩前頭皮質や前嗅核における変化が、NMDA受容体拮抗薬投与モデルに特徴的であることを見出した。